扶芳藤提取物對局灶性腦缺血大鼠腦組織IL-6 含量的影響

肖健 王坤 肖艷芬 祝美珍 黃燕

(廣西壯族自治區南寧市廣西中醫學院 廣西南寧 530001)

【摘要】

目的 探討扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注損傷過程IL-6表達的影響。

方法 取Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組和用藥組,Longa法制作大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型,用酶聯免疫標記法測定腦組織與血清中IL-6的濃度。

結果 扶芳藤提取物能降低再灌注3h、6h、12h、24h后大鼠腦組織與血清中IL-6的表達。結論 扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其抑制腦組織與血清中IL-6的過度表達有關。

【關鍵詞】扶芳藤提取物 腦缺血 IL-6

【中圖分類號】R743.31

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-0742(2008)07(a)-0025-02

表 1 扶芳藤提取物對缺血再灌注不同時間點大鼠腦組織中IL-6 含量的影響( ± s,pg/mL)

注：與假手術組比較,*P <0.01;與缺血再灌注組比較,▲P<0.0126

腦缺血損傷的影響因素很多,包括內源性谷氨酸的大量釋放、神經細胞內鈣離子的超載、凋亡因子的表達失控、線粒體的損傷等。此外,包括IL-6在內的多種細胞因子參與了腦缺血損傷中的炎癥反應,并在再灌注損傷過程中發揮著關鍵作用。本實驗通過線栓法制備大鼠急性腦缺血再灌注模型,利用扶芳藤提取物預防給藥并觀察其對再灌注損傷過程中的IL-6水平的影響,以期進一步了解扶芳藤在治療腦缺血疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物的制備

取扶芳藤1kg,加入相當干藥材10倍量的水,在不銹鋼鍋內煮開后 1h,過濾,保留濾液;藥渣再加以 8 倍于生藥量的水,煮開后文火煎 30min,過濾去渣,合并 2 次濾液,濃縮至相當于原生藥量的容量即1000mL時,取出冷卻;然后加入95%食用乙醇,邊加邊攪拌,直至藥液中含乙醇為80%時,放置48h,在前24h內攪拌3～4次,后靜置24h,過濾去渣,濾液在旋轉回收器中回收乙醇至無醇時,將無醇的液體加熱,濃縮成2.0g生藥/mL 的藥物,保留于4℃冰箱,使用時再用雙蒸水稀釋成所需濃度。

1.2 給藥方式及途徑

藥物組給予扶芳藤提取物灌胃,每100g大鼠每日藥量為2mg,1 次/d,共 2 個月。各組最后一次給藥均在手術前 1h 進行。

1.3 動物與分組

Wistar大鼠96只,雌雄各半,3～5月齡,體重250～300g,由廣西醫科大學動物實驗中心提供,許可證號:SCXK桂2003-0003。隨機分為3組:①假手術組;②腦缺血再灌注模型組(以下簡稱模型組);③腦缺血再灌注給藥組(以下簡稱給藥組)。以上各組均按缺血再灌注3h、6h、12h、24h4個時點分成4 個亞組,每個亞組8 只大鼠,分籠飼養,自由進食,喂標準顆粒飼料,飲自來水。

1.4 動物模型的制作

采用改良Zea Longa′ s法[1]制作大腦中動脈閉塞(middle cere-bral artery occulusion,MACO)模型。 大鼠用10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸部正中線切口,沿胸鎖乳突肌內緣鈍性分離肌肉和筋膜,直到分離出左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,用動脈夾暫時夾閉頸內動脈,結扎頸外動脈近心端及頸總動脈,然后在距頸總動脈近分叉 3～4mm 處剪口,將直徑為0.235mm的釣魚線自切口輕輕插入,插入深度約為(18.5±0.5)mm,縫合皮膚,皮外留線長約 10mm。缺血 2h 后,將釣魚線向外輕輕撥出10mm,即可實現再灌注。大腦中動脈閉塞(MACO)模型制作成功的標準:大鼠蘇醒后表現為:①提尾離地時右前肢內收屈曲;②在地板爬行時向右側劃圈;③站立時向右側傾倒。假手術組按上術方法施行,但僅分離至頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈后即施行縫合術,不插入釣魚線。

1.5 標本收集

每只模型成功的大鼠按不同缺血時間點分明過度麻醉,開胸暴露心臟,將灌流針頭經左心室插入主動脈,先后快速灌入200mL含有 0.01% 肝素的生理鹽水及 200mL4% 多聚甲醛固定液。斷頭取腦,切開兩半球,距額極2.5mm 向后切取 2.5mm 的損傷側腦組織,用電子秤稱重后放入玻璃勻漿器,加入10 倍于腦組織重量的4%多聚甲醛進行組織勻漿,將勻漿以2000r/min轉速離心10min,取上清,封存,置-20℃冰箱待測。

1.6 指標檢測

IL-6 的測定采用雙抗體夾心間接酶聯免疫吸附法，ELISA),ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。各組實驗數據以均數±標準差(- χ ±s)表示,組間采用t檢驗,用SPSS14.0 for Windows軟件進行統計。P<0.05為組間差異具有統計學意義。

2 結果

扶芳藤提取物對缺血再灌注不同時間點大鼠腦組織中IL-6含量的影響見表1,與假手術組比較,缺血再灌注 3h、6h、12h、24h模型組腦組織中IL-6含量明顯升高。與模型組比較,扶芳藤提取物可降低缺血再灌注3h、6h、12h、24h 組 IL-6 水平。

3 討論

IL-6是一種糖蛋白,其分子量介于21～28kD之間,多種淋巴樣細胞和非淋巴樣細胞如T細胞、B細胞、單核細胞、血管內皮細胞、肝細胞、纖維母細胞、成骨細胞均能產生IL-6,顱內IL-6

的主要來源常被認為是中樞神經系統(CNS)中的星形膠質細胞[2]。IL-6的表達在腦組織損傷過程中發揮著雙重作用,正常生理濃度或低水平表達的IL-6對神經元具有保護和促進修復的作用,但快速的IL-6含量增高則可加劇神經元、膠質細胞及內皮細胞的損傷[3]。Wang等[4]

通過對大鼠缺血皮質IL-6、c-fos,及zif268mRNA的表達研究發現,MACO 后 IL-6-mRNA 的表達,3h 顯著增加,12h 達到頂峰并持續到24h;提示IL-6可依此時間段增加蛋白質分子的表達并參與炎癥反應。本實驗中缺血再灌注模型組 IL-6在不同時點的表達與文獻資料相似,并提示缺血再灌注損傷可能與IL-6 的持續高表達有關。

扶芳藤是衛矛科衛矛屬植物,主要分布于我國西南各省區,具有止血化瘀、舒筋活絡的功能,近年來被證實對腦缺血再灌注損傷有一定的拮抗作用,祝美珍等[5]實驗表明扶芳藤合劑預防給藥能對抗腦缺血再灌注損傷過程中c-fos蛋白的表達,肖健等[6]則表明上述合劑能拮抗TNF-α的產生。本實驗結果表明,扶芳藤提取物預防給藥后,大鼠腦缺血再灌注 3h、6h、12h、24h 的腦組織中的IL-6含量下降,提示其有減緩大鼠腦缺血再灌注損傷的可能性,但由于大鼠腦缺血再灌注過程中引起IL-6表達的因素很多,并且IL-6引起腦組織損傷的機制尚不明朗,因此扶芳藤提取物對腦組織的保護作用還需進一步研究。